《动物生物化学》电子教案
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本课程信息
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《动物生物化学》电子教案
生物化学电子教案
动物科学学院
生物技术教研室
绪论（introduction）
【目的与要求】
1. 掌握生物化学的含义、研究对象、研究内容。
2. 了解生物化学的发展过程。
3. 了解生物化学与其它学科的关系特别是生物化学在生命科学中的重要意义。
4. 了解生物化学在工农业生产和日常生活中的应用。
5. 了解生物化学的课程特点与学习方法。
一、生物化学的定义和研究内容
（一）生物化学的定义
生物化学是研究生物体的化学组成和生命过程中的化学变化规律的科学。
具体来说，生物化学就是关于生命的化学，它是利用化学的基本原理和方法来研究生命现象，探讨生命本质的一门科学，是打开生命奥秘的一把钥匙。
（二）生物化学的研究内容
1. 研究生物体的化学组成，这些化学组成的结构、性质和功能（静态生化）。
所有生物体都由三类物质组成：水、无机离子和生物分子（碳氢化合物）。
（1）生物体的元素组成
在地球上存在的92种天然元素中，只有28种在生物体内被发现。
第一类元素：包括C、H、O、N 4种，是组成生命体最基本的元素，约占了生物体总质量的99%以上。
第二类元素：包括S、P、Cl、Ca、K、Na和Mg等，也是组成生命体的基本元素。
第三类元素：包括Fe、Cu、Co、Mn和Zn。是生物体内存在的主要少量元素。
第四类元素：包括Al、As、B、Br、Cr、F、Ga、I、Mo、Se、Si等。
（2）生物分子
生物体和生命现象的结构基础和功能基础，是生物化学研究的基本对象。包括：
生物大分子 糖类、脂类、蛋白质、核酸
生物小分子 维生素、激素、 抗生素、 辅酶、生物碱、毒素等。
各种生物大分子是由基本相同类型的分子单体组成。
2. 生物分子如何在体内进行新陈代谢（动态生化），即在生命过程中如何进行物质代谢和能力代谢的。
3. 上述两方面研究与复杂生命现象的联系。
二、生物化学的发展简史
早期的生化是在有机化学和生理学上研究。20世纪初生物化学成为一门独立的学科。
（一）中国古代对生化的认识和应用
1. 饮食方面
① 公元前21世纪，造酒。以后，制醋。
② 公元前12世纪，制酱。同期，制饴。
③ 公元12世纪，制作豆腐。
2. 医药方面
① 酒曲治疗腹疾。
② 公元前4世纪，《庄子》记载地方性甲状腺肿大—瘿病。7世纪，葛洪《肘后百一方》记载用海藻酒治疗瘿病。
③ 公元7世纪，孙思邈《千金方》记载脚气病，发生在食米区。他首次用猪肝治疗雀目。
3. 营养方面
《素问》：五谷为养，五畜为益、五果为助、五菜为充。
（二）近代生物化学的发展
15世纪下半叶，自然科学冲破宗教的束缚而较快发展起来，近代生化是从18世纪Lavoisier研究的燃烧和呼吸开始的（1783年Lavoisier推翻了燃素学说） ，到1903年，正式提出“生物化学（ biochemistry ）”名称，成为一门独立的学科。
1. 生物化学发展的4个时期：
（1）前期 准备时期。
（2）描述的或有机生物化学发展时期——静态生化阶段（1770-1903）。主要成就有：
① 分离了各种氨基酸、甘油、柠檬酸、苹果酸、乳酸和尿素等。
② 肝中分离出了糖原，发现了DNA。
③ 开始了酶学研究，基本上解决了酶的催化特性、作用条件等。
（3）生理生化发展时期（动态生化）（1903-1950）
主要成就有：
① 分离制备出了多种结晶酶，酶的蛋白质本质被确立。
② 细胞氧化方面，发现了脱氢酶、细胞色素。
③ 维生素分离、制备、功能研究。
④ 酵解、发酵、糖有氧氧化。
⑤ 我国：血滤液制备、血糖测定、蛋白质变性。
（4）分子的或综合生化发展时期（1950年以后）。主要成就有：
① 生化研究技术和设备有了巨大的发展。
② 蛋白质、酶、和核酸分子结构的研究取得了辉煌成果。
1953年，DNA分子的双螺旋结构及“中心法则”的提出，是现代生化发展的一个里程碑。
③ 人工合成了肽激素、催产素等。
④ 代谢的调控研究受到了重视，提出了操纵子学说。
生化方面主要获奖情况：
2. 1937年，英国生物化学家Krebs发现三羧酸循环，获1953年诺贝尔生理学奖。
3. 1953年，沃森和克里克（Watson and Crick）确定DNA双螺旋结构，获1962年诺贝尔生理、医学奖。
4. 1955年，英国生物化学家桑格尔（Sanger）确定牛胰岛素结构，获1958年诺贝尔化学奖。
5. 1980年，Sanger和Gilbet设计出测定DNA序列的方法，获1980年诺贝尔化学奖。
6. 1984年，Bruce Merrifield（美国），建立和发展蛋白质化学合成方法，获化学奖。
7. 1993年，① J.Roberts（美）等 发现断裂基因，获化学奖；② Karg B. Mallis（美）发明PCR方法。③ Michaet Smith（加拿大）建立DNA合成用与定点诱变研究。
8. 1994年，Alfred G. 8. 1997年，主要成就：
① Stanley B.prusiner（美）发现一中新型的致病因子—感染性蛋白颗粒“pnion” （疯牛病），获生理医学奖。
② Paul D.Boyer（美）等，说明ATP酶机制，获化学奖。
9. 1998年，Robert F.Furchgott（美国）等，发现NO是心血管系统的信号分子，获生理医学奖。
Giillman（美）等，发现G蛋白及基因在细胞内信号转导的作用。
我国科技工作者的成就：
1965年人工合成结晶牛胰岛素。
1981年人工合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸。
生物化学是21世纪生命科学的带头学科。
学科热点：
基因组学
蛋白质组学
克隆（组织、器官、个体）
1990. 10. 1 人类基因组计划（Human Genomic Project），2000完成。
三、生物化学与其他学科的关系
1. 生物化学与有机化学关系。
2. 生物化学与微生物、细胞、遗传、生理等学科的关系。
3. 越来越多的其他学科的科学家都参与到生物化学研究中来，使生物化学有了突飞猛进的发展。
四、生物化学的学习方法
本课程特点：
内容多、复杂而繁琐、理论性强、概念多。
建议学习方法：
记好笔记、及时复习、联系实际、多做习题
及时总结、举一反三
在理解基础上有必要的记忆。
几个生物网站：
生物引擎：
医网琴声：
中国生物论坛：
21世纪生物论坛：
基因潮：
生物技术专业网
生物软件网
作业思考:
1、网络查询相关生物反应器的内容或文章，提交到电子邮箱或作业本上。
2、比较理解生物化学与生理学的概念。
3、结合我们西藏实际情况，你认为畜牧、兽医专业学习生物化学的意义在哪里？
第一章
蛋白质化学
CHEMISTRY OF PROTEIN
【目的与要求】
1、了解蛋白质对生物体的重要意义。
2、了解蛋白质的分类，掌握蛋白质元素组成的特点。
3、掌握蛋白质的基本构成单位：氨基酸的结构特点，从各氨基酸的结构特点上理解氨基酸的分类。掌握氨基酸的理化性质，重点掌握两性电离与等电点含义。
4、掌握蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构及结构域的概念。
5、了解蛋白质三级结构、四级结构的概念及稳定因素。
6、充分理解蛋白质结构与功能的关系。
7、掌握蛋白质的理化性质：胶体性质、两性电离与等电点、沉淀作用、变性作用以及这些性质的生理意义及实践意义。
8、了解蛋白质分离提纯的常用方法及基本原理。
【教学重点】
1、蛋白质的化学组成及化学结构，蛋白质的物理、化学性质和分离提纯。
2、氨基酸的结构通式、分类和理化性质。
3、血红蛋白的变构与运输氧的功能，蛋白质的变性和复性。
【教学难点】
1、蛋白质的高级结构。
【教学方法】
教师讲解、学生实验
【教学过程】
一、蛋白质的概念和生物学意义
（一）蛋白质的概念
蛋白质（protein）是构成生物有机体的一类有机含氮的高分子化合物，是生命的物质基础，它是由20种α- 氨基酸通过肽键缩合而成的具有稳定构象的生物高分子。氨基酸作为蛋白质的构件（building-block），按照不同的比例、顺序连接在一起，构成了自然界中种类繁多的蛋白质分子。
（二）蛋白质的生物学意义
早在1878年，恩格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”
可以看出：
第一，蛋白体是生命的物质基础；
第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；
第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。
现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断。
1. 构成生物体的基本成分—结构物质
2. 具有多种生物学功能—功能物质
（1）生物催化—绝大多数酶
（2）代谢调节—多肽和蛋白质类激素
（3）免疫保护—抗体
（4）转运、贮存—Hb、脂蛋白、载体蛋白
（5）运动和支持—肌球蛋白、肌动蛋白、胶原蛋白
（6）控制生长和分化—组蛋白、阻遏蛋白
（7）信息传递—受体、G-蛋白
（8）生物膜的功能
（9）其它：如卵清蛋白、酪蛋白是营养和储存蛋白；胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白；甜味蛋白、毒素蛋白等。
二、蛋白质的元素组成
蛋白质经元素分析，含有大量元素C、H、O、N和少量的S。有些蛋白质还含有微量的P、Fe、Zn、Cu、Mo、I等。
碳 50％~55% 氢 7％~8% 氧 20%~23％
氮 15%~18% 硫 0~3％ 其他 微量
大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质含量：
蛋白质含量（%）=每g样品中含N的g数×6.25
这是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的基础。
三、蛋白质的组成单位 — 氨基酸
氨基酸（amino acid）是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。
从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有20种，除脯氨酸外，均为α-氨基酸。
（一）氨基酸的结构通式
从以上结构通式中，可以看出：
1. 与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸。
2. 除R为H（甘氨酸）外，其它氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子，所以：
① 氨基酸都具有旋光性。
② 每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。
（二）氨基酸的分类
各种氨基酸的区别在于侧链 R 基的不同， 20种基本氨基酸按R的极性和化学结构分类。
1. 根据R基的化学结构，分为：
（1）脂肪族氨基酸
（2）芳香族氨基酸
（3）杂环氨基酸
（4）杂环亚氨基酸
2. 根据R基的极性性质，分为：
（1）非极性氨基酸
（2）极性氨基酸 生理条件下是否带电荷：
① 极性不带电荷氨基酸
② 极性带负电荷氨基酸
③ 极性带正电荷氨基酸
下面分别介绍：
（1）非极性氨基酸（9种） 在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心），有以下几种：
甘氨酸 Gly, G、丙氨酸 Ala, A、缬氨酸 Val, V、亮氨酸 Leu, L、甲硫氨酸 或
蛋氨酸Met, M、异亮氨酸 Ile, I
、苯丙氨酸 Phe, F、脯氨酸 Pro, P、色氨酸 Trp, W
（2）极性氨基酸（11种）
① 极性不带电荷氨基酸（6种） 这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此易溶于水。丝氨酸 Ser, S、苏氨酸 Thr, T、半胱氨酸 Cys, C、酪氨酸 Tyr, Y、天冬酰胺 Asn, D、谷氨酰胺, Gln, Q
② 极性带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）（2种）、谷氨酸 Glu, E、天冬氨酸 Asp, D
③ 极性带正电荷氨基酸（碱性氨基酸）（3种）
赖氨酸Lys, K、精氨酸Arg, R、组氨酸His, H
（三）其他氨基酸
1. 蛋白质中不常见的氨基酸
有些氨基酸虽然不常见，但在少数蛋白质中存在。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸经修饰衍生而来。其中重要的有：
4-羟脯氨酸（4-hydroxypriline,Hyp）、5-羟赖氨酸（5-hydroxylysine, Hyl），它们存在于胶原蛋白中。甲基His、N-甲基Lys在肌球蛋白中存在。 3,5-二碘酪氨酸等在甲状腺球蛋白存在。
2. 非蛋白氨基酸
除了参与蛋白质组成的20-30种氨基酸外，细胞中还找到150多种其他氨基酸，它们不组成蛋白质，但有重要的生理功能。
（1）L - 型α- 氨基酸的衍生物：L -瓜氨酸、L -鸟氨酸是尿素循环的中间物
（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）
（3）β-、γ-氨基酸：β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（递质）。
（四）氨基酸的重要理化性质
1. 一般物理性质
（1）均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。
（2）一般溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。
（3）熔点一般都比较高，都大于
（4）除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。
（5）光吸收 20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区（<220nm）均有光吸收。
在近紫外区（220-300nm）只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有光吸收的能力。
酪氨酸的λmax＝275nm，ε275 =1.4×103、
苯丙氨酸的λmax＝257nm，ε257 =2.0×102
、色氨酸的λmax＝280nm，ε280 =5.6×103
蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大吸收在280nm波长处。可以利用分光光度计测定样品中蛋白质的含量。
2. 氨基酸的酸碱性质
（1）氨基酸的兼性离子形式
氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。原因：
① 氨基酸晶体熔点高，是离子晶格，不是分子晶格。
② 不溶于非极性溶剂，是极性分子。
③ 水的介电常数增高，水溶液中极性分子。
（2）氨基酸的两性解离和等电点
氨基酸在不同的pH环境中，以不同解离状态存在。
在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在；
在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。
当溶液在某一特定pH值时，氨基酸分子上所带正负电荷相等，以两性离子
（兼性离子）的形式存在，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点（isoelctric point），用pI表示
3. 氨基酸的化学性质
（1）α-氨基参加的反应
① 与亚硝酸的反应：
R-CH-COOH + HNO2→ R-CH-COOH + N2↑+ H2O
这儿生成的N2有一半来自氨基酸的氨基。标准条件下测定生成氮气的体积，可计算出氨基酸的含量。这是Van Slyke测定氨基氮的基础。
Lys的ε-NH3也能与亚硝酸反应，但速度较慢。
② 与甲醛的反应（氨基酸的甲醛滴定）
直接对氨基酸进行滴定，终点pH过低（1-2）或过高（12-13），没有适当指示剂。当氨基酸与甲醛反应后，增加了-NH3+解离，pK值下降2-3个单位，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂，用碱滴定。
③与酰基化试剂的反应
另一酰化试剂是丹磺酰氯（dansyl chloride, DNS-Cl），常用于多肽链-NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。生成的DNS-氨基酸有强烈的荧光，可通过电泳或层析进行鉴定，灵敏度很高。
④与烷基化试剂的反应
⑤形成西佛碱的反应
（2）α-羧基参与的反应
氨基酸的a-羧基和其他有机酸的羧基一样，可发生成盐、成酯、成酰胺以及脱羧等反应。
① 成盐反应 氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于水。
② 成酯反应
③ 成酰氯反应 可使氨基酸的羧基活化。用于多肽的人工合成。
④ 脱羧反应 通过氨基酸脱羧酶（decarboxylase）催化，放出二氧化碳，生成相应的一级胺。
（3）α-氨基和α-羧基共同参与的反应
① 与茚三酮反应 茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物—氨和还原茚三酮反应，生成蓝紫色物质（λmax=570nm）。
Pro、Hyp与茚三酮反应直接形成黄色化合物（不释放NH3） （ λmax=440nm）
该反应由 -NH2与 -COOH共同参与，反应非常灵敏（0.5~50µg/ml），应用于氨基酸定性、定量分析（先用层析法分离）。
② 成肽反应 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽。两氨基酸以肽键相连
（4）侧链R 基参加的反应
氨基酸的侧链具有多个功能基团，如羟基、酚基、巯基、吲哚基、胍基、甲硫基等。它们都能与多种试剂起反应，许多反应是蛋白质化学修饰的基础。例如半胱氨酸-SH某些反应：
① 巯基与对氯汞苯甲酸形成络合物：可用于体内解毒
② Ellman反应 半胱氨酸的巯基与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid, DTNB）发生反应：
生成硫硝基苯甲酸在412nm有最大的吸收峰，可测定半胱氨酸的含量。
（五）氨基酸的分析分离
1. 分配层析法的一般原理
层析法：即色谱分析法,是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。
色谱层析法最早由由俄国植物学家茨维特于1903年提出，1941年英国的Martin与Synge提出分配层析法。
分配系数：
当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数。
Kd =CA / CB
利用层析法分离氨基酸的混合物，必须要求氨基酸成分的分配系数要有差异，一般差异越大，越容易分开。
逆流分溶原理：
分配系数大的物质比分配系数小的沿一系列分溶管“移动”的快。
2. 分配柱层析：
支持剂是一些具有亲水性的不溶性物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。
固定相：支持物附着一层不会流动的结合水。
流动相：沿固定相流过的与它不互容的溶剂（如苯酚、正丁醇等）。
填充料构成的柱床可以设想为由无数的连续的板层组成，每一板层起着微观的“分溶管”作用。当流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合样品在两相之间发生连续的分配，分配系数不同的各成分以不同的速度沿柱向下移动。
收集成分用茚三酮显色，以氨基酸量对洗脱体积作图，得洗脱曲线。
3. 滤纸层析
滤纸层析也是分配层析的一种。固定相：滤纸纤维素上吸附的水。流动相：与水互不相溶的溶剂。
4. 薄层层析
薄层层析把支持剂（如纤维素粉、硅胶、氧化铝等）涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。
5. 离子交换层析
离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。
离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯 – 苯二乙烯（交联剂）等不溶性高分子化合物。分为：
阳离子交换树脂：-SO3H （强酸型） -COOH（弱酸型）
阴离子交换树脂：-N（CH3）3OH（强碱型） -NH3OH（弱碱型）如：磺酸型阳离子交换树脂。
分离氨基酸常用强酸型阳离子交换树脂，其基本过程：
① 树脂用碱处理成钠型，
② 将氨基酸混合液（pH2-3，为阳离子）上柱，氨基酸与钠离子交换被“挂”上。结合力取决与静电吸引和疏水作用。一般吸附顺序：
碱性氨基碱＞中性氨基酸酸＞酸性氨基酸
③ 洗脱：用洗脱液将氨基酸从柱上洗脱下来，一般逐步提高pH和盐浓度，洗脱顺序：
酸性氨基酸＞ 中性氨基酸＞碱性氨基酸
四、肽
（一）肽（peptide）的定义
一个氨基酸的α- 氨基与另一个氨基酸的α-羧基之间脱水缩合而形成的化合物称之为肽。氨基酸之间的连接键称为肽键，又称酰胺键。
由2个氨基酸组成的肽为二肽（dipeptide），如由丙氨酸和甘氨酸形成的
二肽：丙氨酰甘氨酸
寡肽（oligopeptide）：10个以下氨基酸缩合。
多肽（polypeptide）： 10个以上氨基酸形成。
（二）天然存在的活性肽
许多分子量比较小的多肽常以游离状态存在，它们通常都具有特殊的生理功能，称为活性肽（active peptide）。
常见的如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、谷胱甘肽、蛇毒多肽等。
1. 谷胱甘肽（glutathione，GSH）
由Glu、Cys、Gly组成的三肽，含一个 γ –肽键。
GSH广泛存在于生物细胞中。含有巯基，有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。还可清除内源性过氧化物和自由基 。
2. 催产素、加压素
均为九肽，分子中含一个二硫键，两者结构类似。
催产素 刺激子宫的收缩，促进分娩。
加压素 促进小动脉收缩，使血压升高。
3. 脑啡肽（5肽）Met——脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
Leu——脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。
4. 短杆菌素S（环十肽），含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。临床用于治疗化浓性病症。
五、蛋白质的结构
蛋白质结构的近代概念：
①蛋白质是由各种α-氨基酸通过肽键连接而成的多肽链（polypeptide chain），再由1条或1条以上的多肽链按各自的方式组合成具有完整生物活性的分子。
②随着肽链的数目、氨基酸组成及排列顺序的不同，就有不同三维结构的蛋白质分子。
③蛋白质的结构层次：通常分为一级结构和空间结构。空间结构又分为二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构。
（一）蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构（primary structure）又称为共价结构、化学结构。
1. 一级结构的定义
1969年国际纯化学及应用化学联合会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸残基的排列顺序。
蛋白质一级结构包括：
多肽链中的氨基酸排列顺序，是蛋白质生物功能的基础；组成蛋白质的多肽链数目； 多肽链中链内或链间二硫键的数目和位置。
蛋白质一级结构的特点：
① 多肽链中的氨基酸已不是完整的分子，而是氨基酸残基（amino acid residue）。
② 习惯上，将肽链末端有游离α-氨基的写在左边，为N端或氨基末端；末端有游离α-羧基的写在右边，为C端或羧基末端。
③ 多肽链中共价键除肽键外，还含有二硫键，它是连接肽链内或肽链间的主要桥键。
3. 常见蛋白质一级结构举例
（1）胰岛素（insulin）是动物胰脏中胰岛β-细胞分泌的一种分子量较小的蛋白质激素。1954 年 Sanger 确定了胰岛素的一级结构。
51个氨基酸残基，分子量：5734，两条链 A链：21aa，B 链 ：30aa
3对二硫键：1对链内（A），2对链间
（2）核糖核酸酶 124个氨基酸、分子量12.6kD，单一肽链、4队二硫键。
4. 蛋白质一级结构的测定
（1）基本策略：片段重叠法＋aa顺序直测法
（2）基本步骤：
① 测定蛋白质分子中多肽链数目；
② 拆分Pr肽链，断开多肽链内二硫键；
③ 分析每一条多肽链的氨基酸组成；
④ 鉴定多肽链N-末端、C-末端aa残基；
⑤ 裂解多肽链成较小的片段；
⑥ 测定各肽段的氨基酸顺序；
⑦ 片段重叠法重建完整多肽链一级结构；
⑧ 确定Cys残基间形成二硫键交联桥位置。
（二）蛋白质的空间结构
蛋白质的空间结构即构象（conformation）或三维结构，是蛋白质分子中所有的原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。它是以一级结构为基础的。
注意构象和构型（configuration ）的区别。
1. 研究蛋白质构象的方法
（1）X-射线衍射法（X-ray diffraction method） 用于测定蛋白质晶体结构。
（2）紫外差光谱
发色团：分子中共轭环系统（芳香环、杂环）。
微环境：极性环境，发色团（处在分子外部）吸收峰向短波长移动—蓝移（blue shift）；非极性环境，发色团（分子内部）吸收峰向长波长移动—红移（red shift）。
2. 多肽链主链折叠的空间限制
（1）肽键的结构特点
肽键是氨基酸之间脱水后形成的共价键，是一种酰胺键。
肽基（peotide group） 肽链中的-CO-NH-，又叫肽单位（peotide unit），肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链。
肽键具有以下结构特点：
① 氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，是一个共振杂化体。肽基的C、O和N原子间的共振相互作用：
② 肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。
正常C - N单键键长：0.145nm
正常C=N 双键键长：0.125
肽键（C - N）键长：0.133nm（40%双键性质）
③ 肽键都是反式构型。但X - Pro形成的肽键可能出现顺、反两种构型。
（2）酰胺平面
① 酰胺平面 多肽链可看成是由一系列酰胺平面组成：
1/3的肽键不能旋转，只有α碳原子连接的两个单键（Cα- N和Cα- C），能够旋转。
二面角所规定的构象是否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非共价键合原子（non-covelently-bonded atom）之间的接近有无阻碍。
（3）拉氏构象图
二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍及Cα上的R基的大小与带电性。
六十年代，Ramachandran等人根据非键合原子之间的最小距离，确定哪些成对二面角所决定的相邻的肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，用Φ作横坐标， Ψ作纵坐标作图，称为拉氏构象图（ Ramchandran plot）。
3. 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构（secondary structure） 指多肽链主链自身通过氢键维系的有规则的折叠和盘绕方式。主要涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。
（1）α-螺旋（ a-helix）
1951年Pauling和Corey研究α-角蛋白时提出。α-螺旋结构是蛋白质主链的一种典型的结构方式，在纤维蛋白和球蛋白中广泛存在。
①α-螺旋的一般特征
每周含3.6个残基，螺距0.54nm，每个残基沿轴上升为0.15nm，螺旋半径0.23nm。
相邻螺圈之间形成链内氢键，方向与长轴平行。每个残基的-NH和前面相隔三个残基的-CO之间形成氢键，氢键封闭的环有13个原子。
-C [ NH-CH-CO ]n=3 N-
典型的为：3.613 –螺旋
侧链基团（R）位于螺旋的外侧。
构成 α- 螺旋的每个Cα都取相同的二面角（Φ= -57°、Ψ= -47°）。
多数呈右手螺旋。但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α-螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly
② 影响α-螺旋形成的因素
多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基（如Lys、Asp、Glu），不能形成稳定的α-螺旋。
Gly连续存在时，由于没有侧链的约束，其Φ可任意取值，所需二面角几率很小，不易形成α-螺旋。
R基大（如Ile）不易形成α-螺旋
Pro由于侧链的吡咯环及Cα没有H参与螺旋氢键形成，使螺旋拐弯（中断），产生一个“结节（kink）”。
R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α-螺旋的形成。如多聚Ala能自发卷曲成α-螺旋。
（2）β-折叠
又叫β-构象（b-conformation）两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链不同肽段）侧向聚集在一起，相邻多肽链主链上-NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠（b-pleated sheet） ，主要存在于β- 角蛋白中。
β-折叠主要特点：
① 氢键与肽链的长轴接近垂直。② 多肽主链呈锯齿状折叠构象。
③ 侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。④ 两个氨基酸之间轴心距为0.35nm（反平行）或0.325（平行）（完全伸展为0.36nm ）。
⑤ β-折叠有两种类型：平行式 （二面角 Φ= – 119°、Ψ= +113° ）即所有肽链的N-端都在同一方向，主要存在于球状和纤维状蛋白质中。反平行式（二面角 Φ= –139°、Ψ= +135° ）即相邻两条肽链的方向相反，主要存在于纤维状蛋白质中。反平行β-折叠比平行的更稳定。
（3）β - 转角和β- 凸起
β - 转角（ b - turn）又叫β - 弯曲（b -bend）、发夹结构（hairpin structure），是一种非重复结构。
在β-转角部分，由4个氨基酸残基组成，弯曲处的第1个氨基酸残基的 -C=O 和第4个残基的 –NH 之间形成氢键，形成 的环状结构。
某些氨基酸如Gly（缺少侧链）、Pro在转角处经常出现。
β- 转角结构主要存在于球状蛋白分子的表面，约占全部碱基的1/4。
（4）无规卷曲（nonregular coil）
没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象。
无规卷曲与生物活性有关，对外界理化因子极为敏感。
4. 超二级结构
超二级结构（super secondary structure）由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。
超二级结构的概念是M.Rossmann于1973年提出，为二级和三级结构之间过渡构象层次。主要组合形式有αα、βαβ、 ββ等类型。
（1）αα类型
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
（2）βαβ类型
由两段平行式的β-折叠通过一段连接链（α-螺旋或无规卷曲）连接而形成。
最常见的是3股平行的β链和2段α-螺旋构成（βαβαβ） ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
（2）βαβ类型
5. 纤维状蛋白质
纤维状蛋白质（fibrous protein）含大量的α-螺旋，β-折叠片，整个分子外形呈纤维状或细棒状，分子轴比（长轴／短轴）大于10（小于10的为球状蛋白质）。分子有规则的线型结构，与多肽链的有规则二级结构有关。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。
（1）角蛋白（ keratin）
来源于外胚层，包括皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，为结构蛋白。
① a-角蛋白
主要由a-螺旋的多肽链组成。
一般是由三条右手a-螺旋肽链形成一个原纤维，肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性。
毛发的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。
② β- 角蛋白
主要存在于蚕丝和蜘蛛丝内。丝心蛋白具有0.7nm周期，是典型的反平行β-折叠，多肽链为锯齿状结构，侧链交替地分布在折叠片的两侧。反平行的β-折叠以平行的方式堆积成多个片层结构。
肽链通常是由多个6肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：
-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-
意味着所有的Gly为位于折叠面的一侧；Ser、Ala位于平面的另一侧。交替层中的Ala（或Ser）残基和Gly残基侧链的连锁（范德华力维系）。
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